Recuperação e alinhamento de sequências de ácidos nucleicos e proteínas

Recuperamos todas as seqüências de coronavírus disponíveis (n = 55) do banco de dados do genoma viral do NCBI ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ) e usamos o GISAID ( Elbe & Buckland-Merrett, 2017 ) [ https: //www.gisaid.org/ ] para recuperar todas as seqüências completas disponíveis (n = 28) do 2019-nCoV em 27 de janeiro de 2020. O alinhamento de várias sequências de todos os genomas de coronavírus foi realizado usando o software MUSCLE ( Edgar, 2004 ) com base no método de associação de vizinhos. Dos 55 genomas de coronavírus, 32 genomas representativos de todas as categorias foram utilizados para o desenvolvimento de árvores filogenéticas usando o software MEGAX ( Kumar et al., 2018) O parente mais próximo foi o SARS CoV. A região da glicoproteína de SARS CoV e 2019-nCoV foi alinhada e visualizada usando o software Multalin ( Corpet, 1988 ). A sequência de aminoácidos e nucleotídeo identificada foi alinhada com o banco de dados do genoma viral inteiro usando BLASTp e BLASTn. A conservação dos motivos nucleotídicos e de aminoácidos em 28 variantes clínicas do genoma 2019-nCoV foi apresentada através do alinhamento de múltiplas sequências usando o software MEGAX. A estrutura tridimensional da glicoproteína 2019-nCoV foi gerada usando o servidor online SWISS-MODEL ( Biasini et al., 2014 ) e a estrutura foi marcada e visualizada usando PyMol ( DeLano, 2002 ).

Semelhança estranha de novas inserções na proteína spike 2019-nCoV para gp120 de HIV-1 e Gag

Nossa árvore filogênica de coronavírus completos sugere que 2019-nCoV está intimamente relacionado à SARS CoV [ Fig1 ]. Além disso, outros estudos recentes vincularam o 2019-nCoV ao SARS CoV. Portanto, comparamos as sequências de pico de glicoproteína do 2019-nCoV com a do SARS CoV (número de acesso do NCBI: AY390556.1 ). Após um exame cuidadoso do alinhamento da sequência, descobrimos que a glicoproteína com pico de 2019-nCoV contém 4 inserções [ Fig.2 ]. Para investigar ainda mais se essas inserções estão presentes em qualquer outro vírus corona, realizamos um alinhamento de várias seqüências das sequências de aminoácidos da glicoproteína de pico de todos os coronavírus disponíveis (n = 55) [consulte a Tabela S.File1] no NCBI refseq (ncbi.nlm .nih.gov) inclui uma sequência de 2019-nCoV [ Fig.S1] Descobrimos que essas 4 inserções [inserções 1, 2, 3 e 4] são únicas para 2019-nCoV e não estão presentes em outros coronavírus analisados. Outro grupo da China havia documentado três inserções comparando menos seqüências de glicoproteínas de pico de coronavírus. Outro grupo da China documentou três inserções comparando menos seqüências de glicoproteínas de pico de coronavírus ( Zhou et al., 2020 ).

Em seguida, analisamos todas as sequências completas disponíveis (n = 28) de 2019-nCoV no GISAID ( Elbe & Buckland-Merrett, 2017 ) em 27 de janeiro de 2020 quanto à presença dessas inserções. Como a maioria dessas seqüências não é anotada, comparamos as sequências nucleotídicas da glicoproteína de pico de todas as sequências 2019-nCoV disponíveis usando BLASTp. Curiosamente, todas as 4 inserções foram absolutamente (100%) conservadas em todas as seqüências disponíveis de 2019-nCoV analisadas [ Fig.S2 , Fig.S3 ].

Em seguida, traduzimos o genoma alinhado e descobrimos que essas inserções estão presentes em todos os vírus Wuhan 2019-nCoV, exceto no vírus 2019-nCoV de Bat como hospedeiro [ Fig.S4 ]. Intrigados com as 4 pastilhas altamente conservadas exclusivas do 2019-nCoV, queríamos entender sua origem. Para esse fim, usamos o alinhamento local 2019-nCoV com cada inserção como consulta a todos os genomas de vírus e consideramos ocorrências com 100% de cobertura de sequência. Surpreendentemente, cada uma das quatro inserções alinhadas com segmentos curtos das proteínas do vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV-1). As posições de aminoácidos das inserções em 2019-nCoV e os resíduos correspondentes nas gp120 de HIV-1 e Gag de HIV-1 são mostradas na Tabela 1. As 3 primeiras inserções (inserção 1,2 e 3) alinhadas a segmentos curtos de resíduos de aminoácidos na gp120 do HIV-1. O inserto 4 alinhado ao HIV-1 Gag. A inserção 1 (6 resíduos de aminoácidos) e a inserção 2 (6 resíduos de aminoácidos) na glicoproteína de pico de 2019-nCoV são 100% idênticas aos resíduos mapeados para a gp120 do HIV-1. A inserção 3 (12 resíduos de aminoácidos) em 2019-nCoV é mapeada para a gp120 do HIV-1 com lacunas [veja a Tabela 1 ]. O inserto 4 (8 resíduos de aminoácidos) é mapeado para HIV-1 Gag com lacunas.

Embora, as 4 inserções representem trechos curtos descontínuos de aminoácidos na glicoproteína de pico de 2019-nCoV, o fato de todos os três compartilharem a identidade ou semelhança de aminoácidos com HIV-1 gp120 e HIV-1 Gag (entre todas as proteínas de vírus anotadas) sugere que este não é um achado fortuito aleatório. Por outras palavras, pode-se esperar esporadicamente uma combinação fortuita para um trecho de 6 a 12 resíduos de aminoácidos contíguos em uma proteína não relacionada. No entanto, é improvável que todas as 4 inserções na glicoproteína com pico de 2019-nCoV correspondam fortuitamente com 2 proteínas estruturais essenciais de um vírus não relacionado (HIV-1).

Os resíduos de aminoácidos das inserções 1, 2 e 3 da glicoproteína de pico de 2019-nCoV mapeados para o HIV-1 faziam parte dos domínios V4, V5 e V1 respectivamente na gp120 [ Tabela 1 ]. Como as inserções 2019-nCoV mapeadas para regiões variáveis ​​do HIV-1, elas não eram onipresentes na gp120 do HIV-1, mas estavam limitadas a sequências selecionadas do HIV-1 [consulte S.File1] principalmente da Ásia e da África.

A proteína Gag HIV-1 permite a interação do vírus com a superfície do hospedeiro carregada negativamente ( Murakami, 2008 ) e uma alta carga positiva na proteína Gag é um recurso fundamental para a interação hospedeiro-vírus. Ao analisar os valores de pI para cada uma das 4 inserções em 2019-nCoV e os trechos correspondentes de resíduos de aminoácidos das proteínas do HIV-1, descobrimos que a) os valores de pI eram muito semelhantes para cada par analisado b) a maioria desses valores de pI foram 10 ± 2 [Consulte a Tabela 1 ]. De notar, apesar das lacunas nas inserções 3 e 4, os valores de pI foram comparáveis. Esta uniformidade nos valores de pI para todas as 4 inserções merece uma investigação mais aprofundada.

Como nenhuma dessas 4 inserções está presente em qualquer outro coronavírus, a região genômica que codifica essas inserções representa candidatos ideais para projetar iniciadores que podem distinguir 2019-nCoV de outros coronavírus.

Análise Evolutiva de 2019-nCoV

Especula-se que 2019-nCoV é uma variante do Coronavírus derivado de uma fonte animal que foi transmitida aos seres humanos. Considerando a mudança de especificidade para o hospedeiro, decidimos estudar as seqüências da glicoproteína de pico (proteína S) do vírus. As proteínas S são proteínas de superfície que ajudam o vírus no reconhecimento e ligação do hospedeiro. Assim, uma mudança nessas proteínas pode ser refletida como uma alteração na especificidade do hospedeiro do vírus. Para conhecer as alterações no gene da proteína S de 2019-nCoV e suas consequências nos rearranjos estruturais, realizamos in-sillicoanálise do 2019-nCoV com relação a todos os outros vírus. Um alinhamento de múltiplas sequências entre as sequências de aminoácidos da proteína S de 2019-nCoV, Bat-SARS-Like, SARS-GZ02 e MERS revelou que a proteína S evoluiu com a diversidade significativa mais próxima da SARS-GZ02 ( Figura 1 ).

Inserções na região da proteína Spike de 2019-nCoV

Como a proteína S do 2019-nCoV compartilha uma ancestralidade mais próxima do SARS GZ02, a sequência de codificação das proteínas spike desses dois vírus foi comparada usando o software MultiAlin. Encontramos quatro novas inserções na proteína de 2019-nCoV- “GTNGTKR” (IS1), “HKNNKS” (IS2), “GDSSSG” (IS3) e “QTNSPRRA” (IS4) ( Figura 2 ). Para nossa surpresa, essas inserções de sequência não estavam ausentes apenas na proteína S da SARS, mas também não foram observadas em nenhum outro membro da família Coronaviridae (figura suplementar). Isso é surpreendente, pois é pouco provável que um vírus tenha adquirido essas inserções únicas naturalmente em um curto período de tempo.

Inserções compartilham semelhança com o HIV

Observou-se que as inserções estavam presentes em todas as seqüências genômicas do vírus 2019-nCoV disponíveis a partir de isolados clínicos recentes ( Figura Suplementar 1 ). Para conhecer a origem dessas inserções no 2019-nCoV, foi realizado um alinhamento local com o BLASTp, usando essas inserções como consulta a todo o genoma do vírus. Inesperadamente, todas as inserções foram alinhadas com o vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV-1). Análises adicionais revelaram que as sequências alinhadas de HIV-1 com 2019-nCoV foram derivadas da glicoproteína de superfície gp120 (posições da sequência de aminoácidos: 404-409, 462-467, 136-150) e da proteína Gag (366-384 aminoácido) ( tabela 1) A proteína Gag do HIV está envolvida na ligação da membrana do hospedeiro, no empacotamento do vírus e na formação de partículas semelhantes a vírus. Gp120 desempenha papel crucial no reconhecimento da célula hospedeira por ligação ao receptor primário CD4. Essa ligação induz rearranjos estruturais no GP120, criando um local de ligação de alta afinidade para um co-receptor de quimiocina como CXCR4 e / ou CCR5.